研究成果表明，mNGS和基于多重PCR的tNGS在細菌和真菌檢測方面的性能相似；在檢測DNA病毒方面，tNGS可能優于mNGS。兩種NGS檢測方法與PCR相比沒有明顯差異。本次研究成果的發表，為迪安診斷基于二代測序的病原檢測產品應用，提供了堅實的研究數據支持。 論文發布截圖
研究背景 肺部感染在全球范圍內廣泛流行，具有較高的發病率及死亡率，構成嚴重醫療負擔。早期、準確的病原學診斷對制定針對性的抗生素治療方案、降低病死率具有重要意義。通過檢測BALF樣本，可以較為便捷地診斷各種肺部疾病，包括肺部感染。 在臨床上，BALF樣本中病原體的鑒定主要基于傳統的微生物培養、顯微鏡涂片和聚合酶鏈式反應(PCR)。 傳統的微生物培養，被認為是感染性疾病病原體診斷的金標準，但它存在檢測周期長，靈敏度低，檢測非典型病原體、病毒和苛養微生物具有挑戰性等缺點。鏡檢涂片的檢出率同樣較低，可供選擇的檢測靶標也較少。此外，PCR檢測需要預設針對病原的特異性引物或探針，因此該方法只能檢測已知病原體，在單次檢測中檢測病原體的能力有限。 近年來，二代測序(NGS)技術結合生物信息學已成為人類病原體檢測、鑒定和分析的有力工具，為應對上述臨床診斷挑戰提供了新選擇。 mNGS是一種不依賴培養、無需預設、無偏倚、全面的微生物檢測和分類學鑒定方法，具有高靈敏度、廣泛的病原體范圍以及檢測新出現病原體的能力，已被證明在肺部感染病原體的檢測和鑒定中具有可行性。然而，mNGS仍面臨諸多挑戰，如成本高、人源基因干擾大、結果判讀困難、無法同時進行DNA和RNA雙流程檢測等。 基于靶向擴增技術和高通量測序技術的tNGS應運而生。目前，tNGS似乎具有檢測靈敏度不受人類基因組和背景微生物影響、檢測成本更低、樣本要求更低、工作流程易于標準化、可同時檢測DNA和RNA病原體等優點。然而，基于多重PCR技術的tNGS在BALF樣本中的病原體鑒定性能尚不清楚。
研究方法 本研究共收集85例疑似感染患者BALF樣本。對每個標本均進行mNGS和tNGS工作流程，分別從樣本維度、病原維度評價并比較mNGS和tNGS在病原體檢測方面的性能。最后，用PCR方法對臨床重點病原體的不一致鑒定結果進行驗證。 研究結果
根據納排標準，最初將來自83名患者的85份BALF樣本納入本研究。隨后，2例樣本未通過tNGS工作流程的QC過程。最后，83個樣本被納入進一步分析。
mNGS和tNGS病原體鑒定 mNGS和tNGS的微生物檢測陽性率分別為95.18% (79/83)和92.77%(77/83)，差異無統計學意義(P =0.625)。 mNGS和tNGS病原體檢測結果如圖1所示，主要檢測到細菌和DNA病毒。mNGS共檢測到244種病原菌。細菌共31種，占檢出總數的47.13% (115/244)；DNA病毒有6種，占檢出總數的33.61%(82/244)；真菌15種，占18.85%(46/244)；寄生蟲檢出1例口腔毛滴蟲，占0.41%(1/244)。 相比之下，tNGS從83份BALF樣本中鑒定出270種潛在病原體。細菌共28種，占檢出總數的40.00% (108/270)；DNA病毒8種，占40.74% (110/270)；RNA病毒8種，占9.26% (25/270)；共檢出真菌8種，占10.00% (27/270)。
圖1：mNGS和tNGS工作流程病原體鑒定結果
mNGS與tNGS結果比較 mNGS和tNGS檢測病原體的一致性如圖2所示。76例(91.57%，76/83)樣本mNGS和tNGS檢測均為陽性，3例(3.61%)兩者均為陰性。76例雙陽性樣本中，9例mNGS與tNGS檢測結果完全一致；60份樣本的mNGS和tNGS檢測結果部分一致，至少檢測到1種相同的病原；其余7例樣本mNGS與tNGS檢測結果完全不一致。 因此，本研究納入樣本的mNGS和tNGS檢測結果完全一致率為14.56%(12/83)，完全不一致率為13.25 %(11/83)，部分一致率為72.27%(60/83)。 圖2：mNGS和tNGS檢測病原體的一致性 圖3比較了mNGS和tNGS檢測每種類型病原、每種病原的陽性樣本數量，并對不同panel范圍和不同報出分類層級的病原進行了特殊標記。RNA病毒和寄生蟲檢出情況的差異是由不同的檢測范圍造成的。 對于細菌，總體陽性率差異無統計學意義。具體而言，兩種工作流程均檢測到的TOP3均為MTBC、流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌，僅胞內分枝桿菌的檢出率差異顯著(P<0.05)，這是由分類學類別不同造成的。對于真菌，兩種方法的TOP3真菌檢出均為煙曲霉、白色念珠菌和耶氏肺孢子菌。病原體陽性率無顯著差異，但由于檢測范圍和分類層級的差異，特定病原體檢測的比例較高，導致mNGS的總體真菌陽性率顯著高于tNGS(P<0.001)。 對于DNA病毒，除細環病毒不在tNGS檢測范圍內外，mNGS和tNGS檢測到的病原譜一致，分別為人EBV、CMV、人皰疹病毒7型、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒1型。另外，EBV(P<0.001)、人皰疹病毒7型(P <0.001)、CMV(P<0.05)和人皰疹病毒6型(P<0.01)的陽性樣本數量具有統計學差異，且tNGS總是具有較高的檢出率，這可能反映了mNGS和tNGS之間的性能差異。 圖3：mNGS和tNGS檢測病原體的結果比較 核心病原驗證
基于mNGS和tNGS結果，對臨床核心病原體結果存在差異的BALF樣本進行PCR正交驗證。如圖4所示，mNGS和PCR的微生物檢出率均高于tNGS，但mNGS和tNGS與PCR的總符合率相同，均為50%。
圖4：關鍵病原體mNGS和tNGS檢測結果不一致的PCR分析
研究總結
本研究系統評估了mNGS和基于多重PCR的tNGS在BALF樣本中的病原檢測性能差異。總體而言，mNGS和tNGS在檢測細菌和真菌方面性能相近，而tNGS在檢測DNA病毒方面可能優于mNGS。兩種NGS檢測方法與PCR相比沒有明顯差異。我們的研究結果為mNGS和tNGS的臨床應用提供了有力的科學依據。
近年來，迪安診斷以二代測序技術為依托，不斷開拓創新，以技術力牽引產品力打造，以產品力引領科研與服務力提升，助力臨床醫生實現精準、快速、全面的感染性疾病診斷。未來，迪安診斷將繼續攜手科研機構與醫療機構，共同推動感染性疾病診療進入新時代。
